数字PCR在环境水体研究中的应用
来源：本站 作者：zhangyang 时间：2025/2/26
在当今环境科学研究中，数字PCR（dPCR）作为一种高灵敏度、高特异性的分子检测技术，正逐渐成为监测水体污染的重要工具。随着全球水资源短缺和水污染问题的日益严重，传统的水质检测方法已难以满足快速、准确的需求。数字PCR通过对目标DNA分子的精确计数，不仅能够有效识别水体中的微生物和污染物，还能为生态保护和水资源管理提供科学依据。本文将探讨数字PCR在环境水体研究中的应用前景及其带来的变革。
一、数字PCR的原理
数字PCR（dPCR）是一种基于PCR（聚合酶链反应）技术的定量分析方法，其原理是将待扩增的DNA样本分配到大量微小反应室中，每个反应室中可能含有零个或一个目标DNA分子。通过进行PCR扩增，只有含有目标DNA的反应室会产生荧光信号。最终，通过统计阳性反应室的数量，利用泊松分布公式，可以精确计算出样本中目标DNA的绝对拷贝数。
这种方法具有高灵敏度和高特异性，能够有效克服传统PCR在定量分析中的局限性。
二、数字PCR与水体研究
1、水产养殖
微生物在有机物去除和氮循环中发挥着关键作用，同时也可能产生有毒的硫化氢（H2S），如果它们对鱼类有致病性或具备益生菌特性，可能会直接影响鱼类健康。目前水产养殖中用于监测某些细菌种类的数量的方法通常精度、特异性、灵敏度较低，并且耗时较长。
研究人员[1]用ddPCR分析了与鲑鱼生产相关的3类细菌，分别是鱼类病原体、可从海产品转移到人身上的人类病原体，以及破环饲养环境威胁鱼类健康的细菌。最后得出结论，数字PCR不仅能对极低含量的细菌gDNA进行定量，而且在复杂样品中依旧能保持如单个样品一致的检测精确性。
2、鱼类种群丰度
测量水样中环境DNA (eDNA)浓度有可能是一种既经济高效又无损的估计鱼类种群丰度的方法。然而，水生系统中固有的非生物和生物条件的时空变异性被认为是确定鱼类eDNA浓度与鱼类种群丰度之间关系的主要障碍。
研究人员[2]将ddPCR方法获得的鱼类eDNA (COI线粒体区域，134 bp)浓度与鱼类种群丰度(即个体数量)和生物量的高精度估计进行了比较。结果显示，在第三次采样时间（ST3），刺鱼eDNA浓度与个体丰度（即鱼类数量）和生物量之间发现了正相关关系（见图2）。同样，在第四次采样时间（ST4），刺鱼eDNA浓度和丰度及生物量之间也发现了正相关关系（见图）。
结论：研究强调了基于ddPCR的eDNA是未来自然系统中鱼类种群丰度量化的一种有前途的方法。
对海洋中鲸、海豚和鼠海豚的物种、亚种或种群进行基因取样鉴定仍然具有挑战性。大多数样本都是通过某种形式的活组织检查收集的，当个体在表面时需要近距离接近血管。另一群科研人员[3]采用数字PCR技术，利用从海水中采集的环境DNA进行鲸类动物的检测和物种鉴定。结果证实了在鲸鱼身后长达2小时内检测到eDNA的潜力。
海洋中采样外置和数字PCR检测结果
3、鱼类的定性与定量
（1）定性——真假鉴别
高价值银鲳鱼(Pampus argenteus)的掺假是世界范围内一个严重的问题，需要对该物种进行准确的鉴定和定量。
研究人员[4]通过建立一种ddPCR方法，检测银鲳鱼。结果表明ddPCR的绝对检测限和定量限分别为 2 copies/μl和 21 copies/μl。对肉类混合物的灵敏度为0.1%，对DNA混合物的灵敏度为0.5%。ddPCR的敏感性是real-time PCR的156倍。
本研究中建立的ddPCR方法可以成为解决物种掺假问题的有价值的工具。
同样，大西洋三文鱼因其独特的口感和丰富的营养价值而受到全球消费者的青睐。然而，由于市场需求巨大，价格较高的大西洋三文鱼常常被价格较低的虹鳟鱼掺假或替代，这不仅损害了消费者的利益，也带来了潜在的健康风险。
传统的检测方法，如形态学特征识别、光谱和色谱技术，虽然在一定程度上能够识别鱼类品种，但存在特异性和灵敏度不足的问题。而基于DNA的检测方法，尤其是实时定量PCR（qPCR），虽然在定性和定量检测中表现出色，但仍受限于扩增效率和DNA模板纯度的影响。研究者[5]建立了一种基于液滴数字PCR (ddPCR)检测的大西洋三文鱼与虹鳟鱼掺假的精确鉴别和定量方法。与实时定量PCR (qPCR)检测相比，所建立的ddPCR方法具有更高的稳定性和准确性。总体而言，基于ddpcr的定量方法具有较高的准确性、稳定性、灵敏度和实用性，适合用于鲑鱼产品的常规监测和质量保证。
（2）定量
鳕鱼的需求量上升，品种鉴定和含量估算对食品的真实性和质量评价具有重要意义。
研究者采用液滴数字PCR技术，建立了阿拉斯加鳕鱼在海产品中的含量测定方法。利用该方法，发现原始样品质量、DNA浓度和DNA拷贝数之间存在线性关系。还建立了一个公式来计算原始样品的重量，基于DNA拷贝的数量。
本研究结果表明，所描述的ddPCR方法适用于海鲜产品中阿拉斯加鳕鱼的定量，并具有应用于食品质量认证的各种任务的潜力。
4、水中病原体-水质监测
军团菌引发的疾病在全球范围内呈上升趋势，这使得监测饮用水中的军团菌成为公共卫生领域的一项重要任务。然而，现有的监测策略主要依赖于基于培养的方法，传统的培养方法耗时长、精度低，而基于PCR的方法虽然快速，但可能同时检测到活细胞和死细胞的遗传物质。
研究者[6]使用了两种常见的商业DNA提取试剂盒（方法A和方法B），对来自家庭淋浴器的水样和生物膜样品进行了处理。
结果显示，数字PCR技术（ddPCR）以其高灵敏度、精确度和无需标准曲线的优势，为病原菌的监测提供了新的解决方案。
相关文献表明[7]，dPCR越来越多地用于测定粪便指示菌、微生物源跟踪标记基因和各种水生环境中的病原体。
优化的dPCR分析方法可以定量微生物的遗传物质，而不需要校准曲线，并且通常具有比定量聚合酶链反应(qPCR)更好的分析性能(即更高的灵敏度、精度和可重复性)。
5、藻类
奥得河发生一起由单细胞藻类土栖藻引起的有害藻华事件，导致了大规模鱼类及其他生物的死亡。这种藻类能产生名为prymnesins的毒素，对水生生物具有极高的毒性。研究团队通过一系列先进的分子生物学技术，对这一生态灾难进行了深入分析。
研究人员[8]从奥得河的两个监测站点收集了水样，并利用ddPCR技术进行了分析。结果显示，样本中检测到的P. parvum ITS2拷贝数最高，达到了约1.14×109拷贝/升。这一结果与显微镜计数的细胞密度相吻合，证实了ddPCR技术在环境样本中的有效性。
结论：本文建立的微滴数字PCR试验将有助于未来监测奥得河或任何其他受盐影响和微咸水体中低水平的细小疟原虫。
参考文献
[1] Netzer L D T .Absolute quantification of priority bacteria in aquaculture using digital PCR[J].Journal of Microbiological Methods, 2021, 183(1).
[2] Capo, Eric, et al. "Droplet digital PCR applied to environmental DNA, a promising method to estimate fish population abundance from humic‐rich aquatic ecosystems." Environmental DNA 3.2 (2021): 343-352.
[3] Baker, C. Scott, et al. "Environmental DNA (eDNA) from the wake of the whales: Droplet digital PCR for detection and species identification." Frontiers in Marine Science 5 (2018): 133.
[4] Cao, Weiwei, et al. "Species identification and quantification of silver pomfret using the droplet digital PCR assay." Food chemistry 302 (2020): 125331.
[5] Ma, X. Y., Shao, Z. L., Yu, X. P., & Wang, Z. L. (2023). A Droplet Digital PCR-Based Approach for Quantitative Analysis of the Adulteration of Atlantic Salmon with Rainbow Trout. Foods, 12(23), 4309.
[6] Cavallaro, Alessio, et al. "The impact of DNA extraction on the quantification of Legionella, with implications for ecological studies." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00713-24.
[7] Tiwari, Ananda, et al. "Application of digital PCR for public health-related water quality monitoring." Science of the Total Environment 837 (2022): 155663.
[8] Mora, Demetrio, et al. "From genes to toxins: Profiling Prymnesium parvum during a riverine harmful algal bloom." Harmful Algae 136 (2024): 102644.
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