来源：本站 作者：zhangyang 时间：2025/2/20

数字PCR检测如何环境DNA？不同原理的数字PCR有何区别？

检测环境DNA（environmental DNA，eDNA）极大地提高了对水生生物的检测，特别是对稀有或濒危物种的。通过聚合酶链反应（PCR），可以收集、提取和扩增在正常活动时从个体中脱落或排泄的eDNA，以揭示栖息地的物种组成。一些研究开始使用定量PCR（qPCR）来证明DNA估计与丰度或生物量之间的显著相关性，但也会出现测不准的情况。不仅如此植物致病菌的诊断也可以通过环境DNA提早检测以提早预防，采用可靠的检测方法对于在无害虫地区建立或传播之前确定害虫的存在至关重要。下面通过两篇文献来了解数字PCR在环境DNA监测中的应用。

实验背景

文章一：柑橘类细菌性溃疡病（CBC），由柑橘黄单胞菌引起的植物疾病。为了在有症状或无症状的植物材料中及早检测出这种病菌，需要对其进行及时的检测。在本研究中通过液滴式数字PCR与实时PCR进行了检测，比较两种检测方法的准确度以及灵敏度。

文章二：由于繁殖的植物材料只在少数几个大型苗圃中生产，然后分发给位于其他地区或国家的其他苗圃。这样增加了感染疫霉的植物被引入新地区的风险。目前尚无有效的手段来控制土源性疫霉菌病，分子诊断可以更准确地鉴定物种，提高疫霉菌的检测。在本研究中，我们评估了利用dPCR和qPCR在多个背景基质中定量烟疫霉的可行性，包括宿主组织（茎和根）和土壤样本。

实验结果

文章一：研究表明DNA提取方法会影响检测试验的可靠性，但是ddPCR受到的影响更小。较低的细菌浓度下，由于Ct之间的差异较大（特别是在qPCR反应）并且由于技术重复之间有更大的可变性。但是数字PCR在检测中更灵敏，且在低浓度样本的检测的结果是qpcr的10倍

文章二：尽管dPCR的动态范围较低（3对数，qPCR为7对数），但该技术被证明在极低拷贝数下具有非常高的精度。dPCR能够在较宽的浓度范围内准确地检测出所有类型样品中的病原体。dPCR是一种非常精确的烟草杆菌鉴定技术，这种方法适用于土壤、茎和根的极低拷贝数。

拓展：dPCR的原理及对比

dPCR的原理是通过有限稀释将含有目的DNA的PCR反应体系分散成无数个单一模板的PCR体系进行扩增，再通过统计检测结果及泊松分布校正实现目的DNA的绝对定量。

    dPCR包括三个步骤：分散体系、PCR扩增和信号检测。通过样品的稀释和分散形成分散体系，这一步是限制dPCR发展应用的一个重要因素，其所引起的分散数量和分散体积的不同极大地影响着定量结果的精度与准确性。分散体系的形成增加了靶分子的有效浓度，并在一定程度上对存在干扰的复杂化合物进行了纯化，提高了靶分子和背景之间的比率。基于dPCR统计的定量方式，反应体系的分散数量越多，低浓度靶分子的检测可能性就越大，检测灵敏度就越高，同时多个单一的反应单元也为多目标序列的高通量检测的发展提供了基础。分散体积的不同会对拷贝数结果的测量产生影响，是造成dPCR精度下降的一个潜在因素，且与检测限的大小形成反比关系。

    dPCR系统根据分散方式的不同可分为三种主要类型：基于油包水微滴生成技术的微滴式数字PCR(droplet digital PCR, ddPCR)、基于微孔芯片的微孔板数字PCR (micro-chamber digital PCR, mdPCR)和基于微流控技术的微流控芯片式数字PCR (microfluidic chip digital PCR, mcdPCR)。

   另外，基于水凝胶珠、琼脂糖珠和生物打印技术等样本分散方式的dPCR虽然尚未商业化，但在现有的实验研究中己取得一定进展。微滴式通过油包裹PCR体系形成无数个油包水微滴，每个微滴是一个独立的反应单元，这种特殊的微滴在进行PCR时能够保证完整的形态，不会互相扩散，也阻止PCR混合物液滴在热扩增过程的蒸发；微孔芯片式是利用光刻技术在硅基上刻蚀出微孔阵列，再通过表面改性、打磨等操作形成数万个纳升级的表面疏水和孔内壁亲水的微反应室；微流控芯片式则是利用微流控芯片装置使PCR反应体系准确快速地分散于芯片孔中，而每个孔都是一个小反应体系(纳升级)。

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