数字PCR在食品研究中的应用
来源：本站 作者：zhangyang 时间：2025/2/19
数字PCR在食品研究中的应用
数字PCR（dPCR）作为一种高灵敏度、高特异性的分子检测技术，近年来在食品研究领域展现出巨大的潜力。它能够精确量化食品中微量目标DNA，快速识别和定量食品中的致病菌、转基因成分及其他重要指标。通过数字PCR，研究人员不仅可以提高检测的准确性，还能缩短检测时间，为食品安全监测和质量控制提供有力支持。在本期文章中，我们将深入探讨数字PCR在食品研究中的具体应用案例，以及它如何推动食品安全和质量的提升。
数字PCR原理
数字PCR（dPCR）是一种基于PCR（聚合酶链反应）技术的定量分析方法，其原理是将待扩增的DNA样本分配到大量微小反应室中，每个反应室中可能含有零个或一个目标DNA分子。通过进行PCR扩增，只有含有目标DNA的反应室会产生荧光信号。最终，通过统计阳性反应室的数量，利用泊松分布公式，可以精确计算出样本中目标DNA的绝对拷贝数。这种方法具有高灵敏度和高特异性，能够有效克服传统PCR在定量分析中的局限性。
数字PCR与食品研究
数字PCR在食品研究领域的应用众多，以下选取几个常用的应用展开讨论。
转基因食品检测
我国非常重视转基因食品安全问题，已建立了一套严格规范的农业转基因生物安全评价和监管制度。我国对转基因食品实行按目录定性强制标识制度。
2023年10月17日《农业农村部关于修改农业转基因生物标识管理办法的决定（征求意见稿）》，其中，一项新规定引起关注，即“单一作物转基因成分含量超过产品3%时应当标识”。根据意见稿这一规定，我国转基因食品标识或将由“定性标识”改为“定量标识”，并设置3%的阈值。
随着转基因生物使用的增加，含有转基因生物的基质也变得越来越复杂。最常见的基于DNA的转基因生物检测和定量方法是实时定量聚合酶链反应(qPCR)。然而，由于qPCR对抑制剂敏感，且定量依赖于标准曲线，在复杂基质的转基因生物定量中应用有限。
为了克服这一障碍，研究者们[1]提出了针对“抗农达”大豆和大豆内参基因的液滴数字PCR (ddPCR)检测方法。对四个真实样本的适用性研究和基于室的PCR系统的使用表明，dPCR在改进转基因生物检测和食品真实性监测方面具有巨大的潜力。
dPCR定量，抗抑制，无需标准品，灵敏度高
食品中病原体鉴定
病毒
乙型肝炎病毒（Hepatitis E virus, HEV）作为引起人类急性病毒性肝炎的重要原因，通过受污染食品的传播在工业化国家中尤为突出。传统的实时定量逆转录PCR（RT-qPCR）技术虽在病毒检测中发挥着重要作用，但在食品样品中病毒浓度低和抑制物质存在的情况下，其定量能力受限。
研究人员[2]开发了一种基于ddPCR技术的双重检测方法，用于食品中HEV的定量检测，检测限（LOD）达到0.34 copies/μL。
同时，研究团队将新开发的ddPCR方法应用于自然污染的野猪肉样本分析。结果显示ddPCR方法能够准确确认样本的阳性和阴性状态，并且在病毒滴度较低的样本中，ddPCR提供了更精确的定量结果。这表明ddPCR技术在检测食品中低浓度HEV RNA方面具有明显优势。
数字PCR技术以其无需标准曲线、精确定量的优势，为食品中病毒的检测和定量提供了新的解决方案。ddPCR技术通过将样品稀释并分配到成千上万的小滴中，每个小滴独立进行PCR扩增，从而实现对目标DNA分子的绝对定量。与传统的RT-qPCR相比，ddPCR不受扩增效率的影响，减少了食品样品中抑制物质对病毒定量的干扰，提供了更高的精确度和灵敏度。
细菌
在食品安全领域，准确检测食品中的病原体是保障消费者健康的关键。然而，传统的检测方法往往存在局限性，特别是在面对病原体处于可存活但不可培养（Viable but Non-Culturable, VBNC）状态时。近期，一项发表在《OncoTargets and Therapy》上的研究[3]，利用数字PCR（Droplet Digital PCR, ddPCR）技术，对面粉中沙门氏菌（Salmonella Typhimurium）的VBNC状态进行了定量检测和生存分析，为食品安全检测提供了新的技术手段。
沙门氏菌是一种常见的食源性病原体，可导致严重的食品安全问题。在VBNC（可存活但不可培养）状态下，细菌虽然代谢活跃，但无法通过常规的培养方法检测，这给食品安全检测带来了巨大挑战。
使用ddPCR，对面粉样本中的沙门氏菌进行了定量检测。实验结果表明ddPCR 技术能够有效区分VBNC状态的沙门氏菌，并准确评估其在不同环境条件下的生存状态。
研究结果显示，ddPCR技术在检测VBNC状态的沙门氏菌时，展现出了比qPCR更高的灵敏度（3copies/μL）和准确性。在评估细胞活性方面，ddPCR与荧光显微镜的结果一致，进一步证实了其在食品安全检测中的潜力。
这项研究不仅证实了ddPCR技术在检测VBNC状态病原体中的有效性，也为食品安全检测提供了新的策略。通过ddPCR技术，可以更准确地评估食品中病原体的风险，从而为消费者提供更安全的食源性产品。
食品中微生物鉴定
乳酸菌参与了肉、奶、鱼、蔬菜等食品的自发发酵。它们是人类胃肠道的共生居民，对人类健康有贡献。作为益生菌，乳酸菌已显示出有益的作用，如预防腹泻和炎症性肠病。乳酸菌的定量对流行病学研究及其在各种利基市场中的作用具有重要意义。
研究者[4]评估了基于分子基因的ddPCR检测方法在植物乳杆菌亚种检测中的适用，将ddPCR的性能特征与定量实时PCR (qPCR)的性能特征进行比较。结果表明：ddPCR技术展现出比qPCR更高的灵敏度，能够检测到更低浓度的乳酸菌。ddPCR技术不需要标准曲线，能够直接提供目标DNA分子的绝对数量，且ddPCR在检测限和定量限方面均优于qPCR。
食品中过敏源鉴定
芝麻作为一种重要的过敏原，其在食品中的微量存在可能引发敏感个体的严重过敏反应。因此，能够准确检测食品中芝麻的存在变得尤为重要。然而，传统的检测方法在灵敏度和精确度上存在局限，难以满足高标准的检测需求。
研究者们[5]开发了两种ndPCR方法，针对芝麻的CO6b-1和ITS区域，实现了在面团/饼干中5和0.1 mg/kg的芝麻检测灵敏度。这一灵敏度比实时PCR提高了整整一个数量级，且不受食品加工过程的影响。
结果显示，无论是在原始面团还是经过烘焙处理的饼干中，ndPCR技术都能稳定地检测到目标DNA，展现了出色的线性、精确度和灵敏度。 与传统的实时PCR相比，ndPCR技术不受PCR抑制剂的影响，提供绝对定量，无需使用校准曲线。这项技术通过将反应液随机高度分割成个体分区，根据荧光信号判断分区是阳性还是阴性，从而计算目标DNA的绝对数量。
研究者还将ndPCR技术应用于商业样品的检测，包括饼干、糕点、能量棒和香肠等，证明了该技术在实际食品检测中的潜力。这些结果不仅为食品生产者提供了一种新的工具，也有助于保护过敏体质消费者的饮食安全。
随着ndPCR技术的不断发展，我们期待它能够被应用于更广泛的过敏原食品检测，包括树坚果、花生、大豆、小麦、鱼类、甲壳类动物、牛奶等。此外，ndPCR技术在多重检测方面的潜力也值得进一步探索，以实现对多种过敏原的同时检测。
食品中品种鉴定
肉类
肉类产品的真实性和可追溯性是确保食品和错误标签(例如包括来自非申报物种的肉类)安全的首要问题。食品掺假(例如，在肉末中添加廉价的切块)在世界范围内经常发生。
研究者[6]应用ddPCR法对肉制品中的牛肉、猪肉、马、羊、鸡肉和火鸡肉进行检测和定量(copy/uL)。对商品肉类进行的分析显示，除了公布的DNA外，还存在其他动物物种的DNA痕迹。详见下表。
结果表明，该方法具有较高的灵敏度、特异性和准确度(准确度100%)。主管食品安全部门可以采用该方法来验证肉制品标签的符合性，并确保从初级生产到消费的整个肉类供应链的质量和安全。
农作物
中国最常见的淀粉类型是马铃薯、红薯、木薯、玉米和小麦。价格差异会导致淀粉掺假。木薯淀粉是较为昂贵的淀粉掺假的主要原料，因此需要灵敏的检测技术来检测和阻止掺假。淀粉的检测主要包括感官检测和理化检测。然而，这些检测方法耗时费力，无法测量掺假程度。
研究者[7]采用液滴数字PCR (ddPCR)技术鉴定淀粉产品中的木薯掺假。分析表明，ddPCR方法检测，木薯质量(M)与木薯提取DNA含量呈显著线性关系，DNA含量与DNA拷贝数(C)也呈线性关系，通过构建的掺假模型验证了该方法的准确性和应用潜力。
结论：该方法可定量测定市售淀粉的掺假程度。ddPCR也可以应用于广泛的掺假检测。
保健品
食品掺假往往导致消费者不信任和不公平的商业竞争。保健食品原料粉的交易形式容易掺假，因此，需要一种有效的粉末产品检测和定性分析方法。
本研究[8]旨在建立、优化和验证一种基于液滴数字PCR (ddPCR)的三七主根粉的准确鉴定和定量方法，为三七质量控制提供依据。选取单拷贝核基因二酰基甘油激酶1基因，设计三七特异性引物和探针。以DNA浓度为换算因子，建立了以DNA拷贝数为基础确定三七粉质量的方程。通过对已知三七散成分的混合粉末样品进行分析，验证了ddPCR方法的准确性。为了验证该方法的适用性，同时对市售产品进行了检测。
该方法精密度高，适用于三七散的定性和定量分析。该方法可作为三七散质量控制的有效工具。
参考文献
[1] Kosir A B , Demsar T , Stebih D ,et al.Digital PCR as an effective tool for GMO quantification in complex matrices[J].Food Chemistry, 2019, 294(OCT.1):73-78.
[2] La Bella, Gianfranco, et al. "Duplex Droplet Digital PCR Assay for Quantification of Hepatitis E Virus in Food." Viruses 16.3 (2024): 413.
[3] Li, Liyan, and Sungwoo Bae. "Quantitative detection and survival analysis of VBNC Salmonella Typhimurium in flour using droplet digital PCR and DNA-intercalating dyes." Microbiology Spectrum 12.8 (2024): e00249-24.
[4] Choi, Chang-Hun, et al. "Comparison of Real-Time PCR and Droplet Digital PCR for the Quantitative Detection of Lactiplantibacillus plantarum subsp. plantarum." Foods 11.9 (2022): 1331.
[5] Villa, Caterina, Joana Costa, and Isabel Mafra. "First nanoplate digital PCR method to trace allergenic foods: Improved sensitivity for the detection of sesame." Food Chemistry 444 (2024): 138650.
[6] Application of the novel Droplet digital PCR technology for identification of meat species[J].International Journal of Food Science & Technology, 2020, 55(3).
[7] Chen J , Zhang Y , Chen C ,et al.Identification and quantification of cassava starch adulteration in different food starches by droplet digital PCR[J].PLoS ONE, 2020, 15(2):e0228624.
[8] Yu, Ning, et al. "A novel analytical droplet digital PCR method for identification and quantification of raw health food material powder from Panax notoginseng." Food Analytical Methods 14 (2021): 552-560.
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