来源：本站 作者：jiyuanbio 时间：2025/2/19

Western Blot 实验是什么？

Western Blot 实验，又叫蛋白质免疫印迹，是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，在蛋白质分析领域占据着举足轻重的地位 。它就像是蛋白质世界里的 “超级侦探”，能够从复杂的蛋白质混合物中精准地找出目标蛋白。

在科研的众多领域，比如生物医学研究中，科学家们想要了解某种疾病相关的蛋白质变化，或者在药物研发中，探究药物对蛋白质表达的影响，Western Blot 实验都能大显身手。它主要有两大关键作用，一是定性分析，判断目标蛋白是否存在；二是半定量分析，比较不同样本中目标蛋白表达量的相对高低 。比如在研究肿瘤细胞和正常细胞的差异时，通过 Western Blot 实验，就能知道某些与肿瘤发生发展相关的蛋白质在两种细胞中的表达情况，是肿瘤细胞中表达量升高，还是正常细胞中表达量更高，从而为肿瘤的诊断和治疗提供重要线索。

样本制备：实验的基石

样本制备是 Western Blot 实验的开篇之作，其重要性如同基石之于高楼。这一步骤的成功与否，直接关系到后续实验能否顺利进行。只有制备出高质量的样本，才能为后续的蛋白质分析提供可靠的基础。

在样本制备过程中，裂解液的选择是首要关键。不同的蛋白质定位需要不同的裂解液，就像不同的锁需要不同的钥匙。比如，对于全细胞蛋白的提取，NP-40、Triton X-100 或 RIPA 裂解液较为常用；而细胞质（可溶）蛋白，Tris-HCl 裂解液更为合适 。一旦样品开始裂解，蛋白降解、去磷酸化和变性也随即开始，所以样本裂解过程中要全程保持低温（冰上或 4℃），所使用的试剂和耗材要提前预冷，并且裂解前几分钟要向裂解缓冲液中加入合适的酶抑制剂来减缓这些反应。

样本制备还有诸多注意事项。裂解液缓冲液 pH 值要合适，一般采用接近生理 pH 的缓冲液，如 Tris-HCl、PBS 等，pH 值太低或太高都有可能引起蛋白的变性、析出。蛋白提取时尽量保证不同样品的盐浓度一致，盐离子浓度不一致会导致蛋白条带宽窄不一；同时裂解液的盐离子浓度不能太高，一般采用接近生理状态的盐离子浓度，防止蛋白盐析；样本盐浓度比较高还会导致蛋白往两边扩散，使得条带越来越宽，最后条带连在一起；也可能会导致泳道内部电流偏大，最后出现笑脸的条带。根据目的蛋白定位选择合适的去垢剂裂解液，常见的去垢剂有 Triton X-100、NP40、SDS 等，不同的裂解液提取强度不同，其中 SDS 及其他离子型去垢剂的裂解液溶解能力最强，最有可能获得最高的得率，但是会破坏蛋白 - 蛋白之间的相互作用，不适合 Co-IP 或者 Pull down 这类实验，如果想尽量保护蛋白 - 蛋白相互作用，避免蛋白变性，需要选择温和的非离子型去垢剂（例如 Triton X-100），或者直接用 Tris-HCl，PBS 这类不含去垢剂的缓冲液借助物理破碎提取可溶蛋白 。提取的样本要尽可能新鲜，裂解前几分钟加相应的酶抑制剂，提取时间要充足，提取全过程要保持低温操作，使用的试剂和耗材要提前遇冷，提取后的样本保存过程中要避免多次反复冻融。

凝胶制备：打造优质分离平台

凝胶制备是 Western Blot 实验中至关重要的一环，它直接关乎到蛋白质的分离效果，就如同搭建舞台，只有舞台搭建得稳固、合适，后续的 “表演”（蛋白质分离与检测）才能精彩呈现。

在制备凝胶时，均一胶的制备尤为关键。要确保凝胶浓度均匀一致，这需要在配制过程中充分搅拌各种试剂，让它们完美融合。不同浓度的凝胶适用于不同分子量范围的蛋白质。低浓度的凝胶（如 5%），就像宽敞的大道，更适合大分子量的蛋白质（大于 200 kDa）在其中迁移；中等浓度的凝胶（10%-12%）则像是城市里的主干道，通常用于分离中等分子量范围的蛋白质（25-200 kDa）；而高浓度的凝胶（15% 或更高）如同狭窄的小巷，适合分离小分子量的蛋白质（小于 25 kDa） 。比如，当我们研究的目标蛋白是分子量较大的胶原蛋白时，就需要选择低浓度的凝胶，让它能够在凝胶中顺利迁移，与其他杂质蛋白分离开来。

在制胶过程中，AP（过硫酸铵）和 TEMED（四甲基乙二胺）的用量控制是一个要点。AP 是引发剂，TEMED 是加速剂，它们共同作用促使丙烯酰胺聚合形成凝胶。用量过多，凝胶会迅速聚合，可能导致凝胶不均匀，还会产生过多的自由基，对蛋白质造成损伤；用量过少，聚合速度过慢，甚至可能无法聚合。聚合时间的把控也不容忽视。聚合时间过短，凝胶未完全凝固，在后续电泳过程中容易变形，影响蛋白分离效果；聚合时间过长，凝胶会变脆，同样不利于实验进行。一般来说，在室温下，凝胶的聚合时间在 30 分钟到 1 小时左右，不过具体时间还需根据实际情况进行调整。制胶时要隔绝氧气，因为氧气会抑制凝胶的聚合，所以在灌胶后，通常会在胶液表面覆盖一层水或异丙醇，形成一个无氧的环境，助力凝胶顺利聚合。

电泳：蛋白分离的关键环节

电泳是 Western Blot 实验中分离蛋白的关键环节，它就像是一场精彩的赛跑，不同分子量的蛋白质在电场的驱动下，在凝胶这个 “跑道” 上展开激烈角逐，从而实现分离。

在进行上样与电泳时，诸多要点需要牢记。为了实时观察电泳进程，判断蛋白分子量大小，同时检验转膜效果，使用预染蛋白 Marker 是个不错的选择。比如，在研究某种未知蛋白质时，通过预染蛋白 Marker，就能直观地看到不同分子量的标准蛋白在凝胶中的迁移位置，从而推测出未知蛋白的分子量范围 。

上样时，要尽量保证每个泳道的蛋白量一致，体积也尽量相同。这就好比给每个参赛选手提供相同的装备和资源，让比赛更加公平。如果蛋白量差异过大，就像有的选手负重过多，有的选手则轻装上阵，会导致条带的亮度和宽度出现明显差异，影响后续的分析判断。一般来说，对于全细胞裂解液，上样量在 20 - 50 μg 较为合适；对于纯化的蛋白，上样量可以在 1 - 5 μg 。

如果有空置的泳道，一定要用等体积的 1x Loading Buffer 补齐，这一小小的举动却有着重要作用。它能平衡电场，防止电场不均匀导致最后的一两个样品条带上扬，就像给天平的两端放上相同重量的砝码，让天平保持平衡。

在电泳过程中，也可能会遇到一些问题。比如，电压过高，蛋白质在凝胶中跑得过快，就像赛跑选手速度过快，容易失控，可能会导致条带变形、分辨率降低；电压过低，电泳时间过长，不仅浪费时间，还可能会使蛋白质扩散，条带变宽 。如果出现条带弯曲或拖尾的情况，可能是凝胶制备不均匀，就像跑道坑洼不平，影响选手的奔跑；也可能是缓冲液离子强度不对，需要重新检查缓冲液的配方并新鲜配制。

转膜：蛋白转移的精细操作

 

转膜是 Western Blot 实验中不可或缺的关键步骤，它肩负着将在凝胶中分离的蛋白质精准转移到固相膜上的重任，为后续的抗体检测搭建起关键的桥梁。转膜的原理基于蛋白质的带电特性，在电场的强大驱动下，带负电荷的蛋白质从凝胶有序地迁移至膜上 。这一过程就像是一场精心策划的搬迁行动，让蛋白质从凝胶这个 “临时住所” 顺利转移到膜这个 “新家”，并且在转移过程中，蛋白质能够保持其在凝胶中的相对位置和分辨率，为后续的抗体识别和检测奠定坚实基础。

在转膜方法的选择上，主要有湿转、快速湿转和半干转这几种主流方式。常规湿转，如同一场在 “水世界” 里的转移之旅，通过制作 “海绵垫 - 滤纸 - 膜 - 凝胶 - 滤纸 - 海绵垫” 这样的三明治夹板结构，放入充满转膜缓冲液的转膜槽中，在电场力的强力作用下，蛋白质从凝胶缓缓转移到膜上 。它的优点十分显著，转膜效果极为完全，就像搬家时所有物品都能被妥善安置，因此应用广泛，是众多科研人员的常用之选。然而，常规湿转也存在一些小缺点，所需时间较长，就像一场漫长的搬家过程，可能会耗费较多的时间和耐心。而快速湿转能在一定程度上解决时间长的问题，比如中科通仪就有相关的快速湿转设备，能够满足一些对时间有更高要求的实验场景 。半干转则与湿转有所不同，它在固定胶 / 膜叠层及施加电场的仪器上另辟蹊径。其优点是转膜速度较快，能够在较短的时间内完成蛋白质的转移，就像一场高效的快速搬家。但它也有不足之处，对于某些蛋白质的转膜效率可能略低于湿转，在转移过程中可能会出现一些小状况，导致部分蛋白质的转移效果不够理想。

在转膜过程中，有诸多注意事项需要我们格外关注。膜的选择至关重要，Western Blot 实验中常用的转印膜主要有 PVDF 膜（聚偏二氟乙烯膜）和 NC 膜（硝酸纤维素膜） 。PVDF 膜机械强度高，化学相容性好，灵敏度高，分辨率和蛋白亲和力都很出色，尤其适合分子量较小的蛋白质检测，就像一把精准的 “小蛋白探测器”。不过，它通常需要用甲醇 / 乙醇预先活化，在使用前需要多一道准备工序。NC 膜则背景低，可结合蛋白质和核酸进行各种印迹应用，是一种较为经济实用的选择 。但它对于分子量较小的蛋白质在洗涤时容易丢失，且韧性较差，操作时需要格外小心，否则容易破碎。在选择膜时，还需要考虑膜的孔径大小。通常，Western Blot 转印膜有 0.2μm 和 0.45μm 两种孔径 。0.2μm 的膜如同一张细密的滤网，更适合小于 20kD 的蛋白或低丰度蛋白的检测；而 0.45μm 的膜则像是一张普通的滤网，更常用，适合大于 20kD 的蛋白。

在操作过程中，要小心避免气泡的产生。气泡就像隐藏在转膜过程中的 “小捣蛋”，会阻碍蛋白质的正常转移，导致转膜不均匀，出现条带缺失或变形等问题。我们可以在组装转膜三明治结构时，用玻璃棒轻轻滚动，将气泡赶出，确保蛋白质能够顺利转移。

温度的控制也不容忽视。转膜过程中会产生热量，如果温度过高，就像给蛋白质 “蒸桑拿”，可能会导致蛋白质变性，影响后续的检测结果。我们可以使用冰袋或凝胶状冷却包来提供有效的降温，让蛋白质在一个舒适的 “温度环境” 中完成转移。

电极方向的正确性也至关重要。如果电极方向接反，就像指南针指错了方向，蛋白质不仅无法顺利转移，还可能会反向迁移，导致实验失败。所以在转膜前，一定要仔细检查电极方向，确保万无一失。

免疫检测：精准识别目标蛋白

免疫检测是 Western Blot 实验的关键环节，它就像一场精准的 “蛋白质识别游戏”，利用抗原抗体特异性结合的原理，从众多蛋白质中精准地找出目标蛋白。这一过程就像是在茫茫人海中寻找特定的某个人，而抗体就是那把独一无二的 “钥匙”，能够准确地开启目标蛋白这把 “锁” 。

在免疫检测过程中，封闭是重要的第一步。封闭的目的是用无关蛋白填充膜上的空白位点，防止抗体非特异性结合，就像用填充物填满房间的空隙，让抗体只能与目标蛋白结合 。常见的封闭液有 5% 脱脂奶粉和 3% BSA（牛血清白蛋白）。对于一般的蛋白质检测，5% 脱脂奶粉是经济实惠的选择；而在检测磷酸化蛋白时，由于奶粉中含有酪蛋白（一种磷酸化蛋白），可能会导致背景信号过高，所以更推荐使用 3% BSA 作为封闭液 。

抗体孵育是免疫检测的核心步骤。一抗是与目标蛋白特异性结合的抗体，它的浓度和孵育时间对实验结果有着至关重要的影响。抗体浓度过高，就像在房间里放了太多的人，可能会导致非特异性结合增加，背景信号增强；抗体浓度过低，则可能会使目标蛋白无法被充分识别，信号变弱 。孵育时间也需要根据实际情况进行调整，一般来说，室温孵育 1 - 2 小时或者 4℃过夜孵育都是常见的选择。4℃过夜孵育虽然时间较长，但可以让抗体与目标蛋白充分结合，提高检测的灵敏度 。二抗是与一抗结合的抗体，它通常带有标记物，如辣根过氧化物酶（HRP）或荧光素，用于后续的信号检测。二抗的选择要与一抗的来源物种相匹配，比如一抗是小鼠来源的，二抗就应该选择抗小鼠的抗体 。

洗膜是免疫检测过程中不可或缺的步骤，它的作用是去除未结合的抗体和杂质，确保检测结果的准确性。洗膜时要使用合适的洗膜液，如 TBST（Tris 缓冲盐溶液加 Tween - 20）或 PBST（磷酸盐缓冲盐溶液加 Tween - 20） 。Tween - 20 是一种非离子表面活性剂，能够降低表面张力，帮助去除非特异性结合的抗体 。洗膜次数一般为 3 - 5 次，每次 5 - 10 分钟。洗膜不充分，就像衣服没洗干净，会残留未结合的抗体，导致背景信号过高；洗膜过度，则可能会洗去部分与目标蛋白结合的抗体，使信号减弱 。在洗膜过程中，要注意轻轻晃动容器，让洗膜液充分接触膜的表面，确保洗膜效果均匀一致。

总结

Western Blot 实验全流程涵盖了样本制备、凝胶制备、电泳、转膜以及免疫检测等多个关键步骤，每一个步骤都如同精密仪器中的一个部件，任何一个环节出现偏差，都可能影响整个实验的结果。从样本制备时对裂解液的谨慎选择，到凝胶制备中对浓度、聚合时间的严格把控；从电泳时对蛋白上样量和电压的精准调控，到转膜时对膜的类型、孔径以及转膜条件的细致考量；再到免疫检测中对封闭液、抗体孵育和洗膜的精心操作，每一处细节都承载着实验成功的希望。

在实际操作中，大家要充分理解每个步骤的原理和要点，严格按照规范进行操作，并且不断积累经验，根据不同的实验目的和样本特点，灵活调整实验条件。只有这样，我们才能在这个充满挑战的实验过程中，获得准确、可靠的实验结果。希望大家在今后的科研道路上，通过不断地探索和实践，能够熟练掌握 Western Blot 实验技术，为科研工作的顺利开展奠定坚实的基础，在蛋白质研究的领域中收获更多的成果。