NGS配套方案
来源：本站 作者：admin 时间：2019/1/15
NGS配套方案
前言
高通量测序技术（又称二代测序技术）是对传统测序一次革命性的改变，有些文献中称其为下一代测序技术（next generation sequencing）。高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(Deep sequencing)。目前高通量测序平台的代表是Illumina、ABI。
二代测序经典路线大致如下： 得到初始样本（Retsch冷冻研磨样本制备系统+耶拿C16核酸抽提系统）→初始样本质控与定量（NanoDrop One超微量分光光度计或Bio-Tek Epoch分光光度计+Qubit 3.0）→初始样本片段化（Covaris M220或Bioruptor）→ Fragment Clean up、加接头或建库过程中的液体处理（Caliper自动化工作站：Zephyr或Sciclone NGS）→特定大小片段回收、去除接头（Blue Pippin）→文库质控及 定量（Qsep1）→PCR扩增（耶拿TAdvanced SG PCR仪）→测序及生物信息学组装/分析（Partek Genomics Suite）
具体方案如下：
一、 样本处理
冷冻混合研磨仪MM400
冷冻混合研磨仪MM400的研磨罐在水平方向上进行圆弧式径向振动。罐内的球体由于其惯性作用对位于光滑的研磨罐内额壁上的样品进行带有高能量的撞击，并以此粉碎样品。研磨罐的转动加上研磨球的运动对样品产生了高强度的混合作用。通过使用多个小球甚至可以进一步的提高混合的效果。当使用很多个小球时（如玻璃球），生物细胞就可以被破碎了。球与球之间的摩擦撞击作用可以有效导致细胞的破碎。
冷冻混合研磨仪MM400应用实例
纤维组织、骨头、头发、化学品、药丸、药材、药片、矿物质、金属矿石、合金、玻璃、陶瓷、土壤、污泥、植物组织、谷物颗粒、油籽料、合成材料、废料样品、毛料、塑料、RoHS样品以及纺织品等。
二、 核酸提取
全自动核酸提取仪InnuPure C16 touch
智能：人性化试剂盒设计
预装封膜试剂条/板，一次可同时提取1-16个样品。所有试剂盒都是即用型，日常操作非常简单省时。试剂盒无需分装，节省大量分液时间，最大限度减少人工操作。预装试剂也避免了人工分装可能出现的错加/漏加，加样过程中因多加而导致的溢液污染。同时试剂盒中包括提取所需的全部试剂/耗材和预装试剂，无需您额外购买。
历史：25年以上的高精度移液经验
可靠性：有效避免交叉污染
独特优势：移液头穿孔功能，避免了撕膜带来的试剂间污染
1ml带滤芯的枪头，避免了移液头和样品之间的污染
预装封膜的试剂，避免了试剂分装的污染
UV灯灭菌，有效消除批次间样品的污染
运行时仪器前门完全封闭，阻隔外部环境污染
三、 DNA质控
此款符合人体工程学的独立式分光光度计具有高分辨率和触摸屏界面设计，使您离研究目标更进一步。 强大的自动调 节光程技术有助于准确测量浓缩样品而无需稀释。
Acclaro 样品智能技术
Acclaro 技术可以在提供准确的定量测定的同时，增强用户对样品质量的了解。 对污染物的早期鉴别能够避免下游应用的失败，从而节省故障排除的时间。
在数秒内验证样品结果 - 鉴别样品污染物并获得矫正的浓度结果。
通过警报获取信息 – 通过提供相应的技术支持和解决问题向导，从而获得样品质量的即时反馈。
依靠准确结果——采用嵌入式传感器和数字影像分析技术，确保测量完整性。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 特点
同时包含基座和比色皿检测模块，以扩展实验灵活性和扩大动态范围。
测量稀释样品，执行动力学实验并获取细菌培养物的光密度测量结果。
比色皿检测模块包括温度控制和搅拌区域。
NanoDrop One/NanoDrop OneC 增强功能
符合人体工程学的独立式设计 – 集成 Android™ 平板而无需单独的计算机，能够通过无线网络*、以太网或 USB 实现数据的无缝传输。
自动测量与自动调零功能 –降下检测臂即可实现即时测量，以此简化多样品处理流程。 仅需触摸一下屏幕，即可实现这些功能的“开”或“关”。
更广的动态范围——采用自动调节光程技术，无需对高浓度样品（dsDNA 高达 27,500 ug/μL）进行稀释
集成式学习中心——仅需指尖滑动，即可浏览经存档的技术支持文档与教学动画。
四、 DNA定量
Qubit® 荧光定量仪
与传统紫外分光法不同，Qubit®3.0采用专门的荧光检测技术和染料，特异性的区分出DNA，RNA，降解核酸，游离核苷酸及蛋白质，即便在低浓度下也具有极高的灵敏度和准确性。
选择性——采用荧光染料，特异识别并定量dsDNA， oligos，RNA，microRNA
准确——比传统紫外分光光度计更加准确
灵敏——最低检测1uL样品，准确定量浓度仅为10 pg/uL 的DNA和12.5 ug/mL的蛋白
简单——易于使用的触摸屏界面和Android系统，全新的双核处理器加快计算速度
五、 DNA片段化
Covaris
M220自动聚焦声波基因组剪切仪
自动声波聚焦（Adaptive Focused Acoustic™, AFA)技术 ，是将高速发展的医用超声显像诊断（低强度聚焦超声）与体外震波碎石治疗（高强度聚焦超声）的技术优势结合起来，并与先进的微处理器及机器控制结合起来，可以应用在多种生命科学研究中。AFA技术原理实质上是一个受控的液体空腔化的动力学过程，简单可理解为：当声波通过液体时，产生的微小气泡迅速膨胀，随后由于液体迅速返回空穴导致气泡崩溃，从而产生液流剪切力，Covaris AFA技术就是通过控制这种气穴作用来控制剪切力，即成百上千个空化气泡的累加作用，产生的液流冲击力>100m/sec，AFA技术即通过计算机控制和仪器及耗材各部分的精确设计，从而控制作用在样本上的剪切力将核酸剪切到目的大小。（如下简图）
空气气泡 气泡崩溃产生液流剪切力
二代测序应用领域：
还没有参考序列的物种：在基因组水平上进行重头测序（de novo sequencing），获得该物种的参考序列，为后续研究和分子育种奠定基础；
有参考序列的物种：进行全基因组重测序（resequencing），在全基因组水平上扫描并检测突变位点，发现个体差异的分子基础。
转录组水平：进行全转录组测序（whole transcriptome resequencing），从而开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性（cSNP）等研究；
转录组水平：与染色质免疫共沉淀（ChIP）和甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）技术相结合，从而检测出与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点。
小分子RNA测序（small RNA sequencing）：通过分离特定大小的RNA分子进行测序，从而发现新的microRNA分子。
二代测序结合微阵列技术而衍生出来的应用--目标序列捕获测序技术（Targeted Resequencing）。这项技术首先利用微阵列技术合成大量寡核苷酸探针，这些寡核苷酸探针能够与基因组上的特定区域互补结合，从而富集到特定区段，然后用第二代测序技术对这些区段进行测序。目前提供序列捕获的厂家有Agilent和Nimblegen ，应用最多的是人全外显子组捕获测序。科学家们目前认为外显子组测序比全基因组重测序更有优势，不仅仅是费用较低，更是因为外显子组测序的数据分析计算量较小，与生物学表型结合更为直接。
目前，外显子组测序开始广泛应用于寻找疾病的候选基因上。
以上领域的测序都需要进行核酸片段化，M220是目前最主要的片段化工具。
六、 PCR扩增
Biometra TAdvanced 96 PCR仪
有镀金纯银样品槽、金色合金等多种样品模块可选，实现高效传热品槽通量灵活，有96孔、60孔、384孔等，模块可更换精准的温度控制：通过智能的温度控制系统RAC实现快速的升降温变化、优异的温度准确性和均一性，以及高度的重复性线性温度梯度工具（LGT）：实现准确的温度梯度设置和控制，极大地方便了退火温度的优化（带温度梯度的型号）高性能智能热盖（HPSL）：深凹的热盖设计可有效地将热量控制在热盖内，防蒸发效果极佳静音技术（WQT）：运行时非常安静，无噪音，提供舒适的工作环境巧妙的散热设计：通过仪器后部和底部进行高效散热，仪器旁边可放置其他仪器，节省实验室空间仪器自检功能：可进行自动的检测诊断，提供各种运行和故障信息
七、 RNA样本质量控制
Bioptic Qsep1生物分析仪
Qsep1生物分析仪是一款便携式毛细管电泳仪，基于毛细管电泳中待测样品在电场作用下离子迁移速度不同而对组分进行分离和分析的原理，克服传统凝胶电泳实验耗时耗力有污染等弊端而研发的一款高性能的全自动化毛细管核酸分析仪。它既可用于电泳分离，同时对每一个片段的大小进行精确测定和浓度定量。
Qsep1生物分析仪的操作系统非常简便，简化了繁复的操作与流程，能让一般用户在5分钟内学会操作系统，1分钟分析样品得出结果。它将传统实验室的多个繁杂步骤：包含样品准备、配胶、点样、跑胶、拍照及结果判读，整合简化为单一步骤。使用可抛弃式卡夹，使复杂的生物样本分析以快速、精确、低成本的方式得以实现。其高通量、高分辨率、高灵敏度、全自动、标准化、无污染的特点赋予了其强大的检测分析功能。
Qsep1生物分析仪可代替传统凝胶电泳，适用于分子生物学实验室、教学实验室、快速检测中心、户外检测等需要快速出结果、样本量少的实验室。
产品特点：
Qsep1生物分析仪，采用可抛弃式的预制胶卡夹，即插即用，全自动进样，无须人工制胶、灌胶、上样，免去了手工制胶的繁琐和人工上样的 误差，可用于核酸质控和PCR产物电泳，分辨率高，重复性好，可处理1-8个任意个数样本，真正实现了核酸片段和蛋白的快速、自动化、高通量、高分辨率 分析。
全自动进样：自动分析1-8个样本
抛弃式卡夹：无需制胶，灌胶，每支卡夹可分析100-300样品（DNA,RNA和Protein）
快速分析：可达1分钟内/样品
高灵敏度：可达pg级
高分辨率：最佳可达1-4bp
结果呈现：数字数据，凝胶成像图，毛细管电泳图
软件分析：同时进行定性及定量分析，界面友好，操作人性化
样品需求和消耗：最低样品需求量1μL，上样量小于0.1μL
低成本：市场上最经济的仪器和耗材费用
应用：
•遗传分析 •限制片段长度多态性分析 (RFLP)
•PCR 产物检测 •质粒DNA酶切，构造及纯度分析
•Genomic DNA & NGS 质控 •高分辨率多重PCR分析
•DNA 引物质控（Primer QC) •STR/微卫星（SSR）
•总RNA，cRNA，片段化RNA，micro-RNA质控 •合成寡核苷酸片段分析
八、 样本定量
荧光定量基因扩增仪qTOWER3
来自德国耶拿的全新一代荧光定量基因扩增仪qTOWER3 touch系列，采用独特的4个高效LED固态光源作为激发光源，并通过专利性的光纤扫描系统来采集荧光信号，确保市面上常用的荧光定量PCR染料都能得到出色稳定的激发和检测。灵活的检测通道配置，升级方便，最高可实现六重目的基因的同时检测。耶拿公司具有近三十年的基因扩增仪研发制造历史，快速且耐用的镀金纯银样品槽使其96孔温度均一性达到± 0.15 ℃。选配的12列线性温度梯度功能使用户能快速确定最佳的PCR退火温度进而优化反应条件，是用户优化PCR程序的得力助手。用户可以选择用电脑来操控仪器，也可以选择用彩色触摸屏来操控仪器。它具有开放的试剂和耗材系统，适用于标准的96孔PCR板、8联管或者PCR单管。
快速反应：
镀金纯银样品槽，最大升温速率为8℃/s，热导性好，且耐腐蚀抗氧化
精准控温：
温度准确性为±0.1 ℃，96孔的温度均一性为±0.15 ℃，精准的温度控制带来稳定且特异性好的扩增效果
线性温度梯度：
独特的12列线性温度梯度功能，能帮助用户快速找到最精准的退火温度
自动热盖：
采用先进的自动热盖技术，仪器自动控制热盖的压力，确保有效的防蒸发效果
耗材开放：
对耗材没有特殊要求，用户可自由选择96孔板、8联管或单管，使用方便
高强度宽光谱的激发光源：
采用蓝色、绿色、红色、白色（RGBW）四个高强度长寿命LED固态光源，确保在整个光谱检测范围内都有很强的光强，提高检测灵敏度，而且不发热，使用寿命长，终身免维护
高灵敏度检测器：
最新型的通道式光电倍增管检测器，检测灵敏度更高
快速扫描检测：
8道光纤扫描检测快速，即使完成六通道的96孔扫描，也只需要6s
无需光路校正：
扫描检测能确保每孔的信号激发和检测光程都完全一致，无需光路校正，因此无需额外占用一个校正通道，可实现真正的六通道基因检测
检测通道配置灵活：
用户可根据需求灵活选择通道数和各通道的检测滤光片组, 有12种不同波长的滤光片组可选择以配置成1-6通道的检测系统，包括滤光片错配的FRET检测组合和专用于蛋白熔解曲线分析的滤光片组，覆盖从蓝光到红光的全光谱，通道数可以随时方便升级，以满足未来更多的检测需求
九、 片段回收
Blue Pippin全自动核酸片段回收系统
Blue Pippin
回收的片段范围：50bp－50kp
样品通量：1－5个样品
回收效率：50－80％
创新的技术
Pippin Prep系统包括一次性的5泳道预制胶电泳槽，一个带有DNA荧光检测光路单元(非紫外)的电泳平台。
运行中，软件通过实时光路检测，和参考泳道中的DNA ladder进行比对，确定已经设置回收长度范围的DNA片段到达洗提泳道(elution channel)的准确时间
通过电极切换，打开洗提泳道，使目标片段进入洗提通道的回收室中，从而实现回收。然后电极再次切换，洗提泳道关闭，剩余的DNA分子进入原先的分离泳道(separation channel)。
自动化核酸片段回收 VS传统切胶回收
手工切胶回收Pippin Prep/Blue Pippin 几个小时的手工操作 几分钟的手工操作 回收的核酸片段大小不精确 精确回收指定大小范围的核酸片段 存在小分子量（LMW）污染 去除小分子量（LMW）污染 30-50％的回收效率 50-80％的回收效率 回收中、小核酸片段 可以回收大的核酸片段
应用范围
下一代测序，亚克隆，转基因等等
小分子量或者大分子量的核酸片段回收
大小很近的核酸片段的区分回收
珍贵的微量样品中的核酸片段回收
